【研究領域課題番号】20K05954 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

tRNA / 翻訳 / タンパク質合成 / 遺伝暗号解読 / コドン / リボソーム

【研究成果の概要】

前年度では翻訳中ペプチジルtRNAの抽出法を確立させたが、レポーター遺伝子のテストコドンを解読したペプチジルtRNAのみを精製する方法を確立することができなかった。そのため、今年度は一部方針を変更し、各アミノ酸のコドンを1種類に限定したレポーター遺伝子を大腸菌細胞内または無細胞翻訳系で発現させ、抽出したペプチジルtRNAのtRNA部分を配列解析することによってアイソデコーダーの使用頻度を算出する方法の確立に取り組んだ。レポーター遺伝子は３種類設計した。また、前年度に課題となったペプチジルtRNA以外のtRNAの非特異的な混入を解決する方法として、選択的デアシル化とデアシルtRNAの3’末端処理を組み合わせることによってペプチジルtRNAのみをアダプターにライゲーションする方法を試行錯誤し、最終的にその確立に成功した。これらの方法を用いて、上記のレポーター遺伝子を大腸菌細胞または無細胞翻訳系によってそれぞれ発現させ、ペプチジルtRNAを抽出し、ＮＧＳ解析によって各tRNAの定量解析を行った。この時、tRNAプール中の各tRNAの存在量比を測定するため、未処理の全tRNA画分についても定量解析を行っている。その結果、無細胞翻訳系では、特定のアイソデコーダーtRNAにしか読まれないコドンを有したレポーター遺伝子ではそれぞれ対応するtRNAの相対量が顕著に高く検出されたことから、実験系が機能していることが証明できた。また、複数種のアイソデコーダーtRNAによって読まれるコドンについては、アイソデコーダーtRNAの使用頻度はtRNAプール中の存在比とは異なり、コドン種によって特徴があることが分かってきた。一方、大腸菌細胞のデータではそのような差が見られなかった。これはレポーター遺伝子の発現量が内在遺伝子の発現量を凌駕できずそれら由来のペプチジルtRNAによるものと考えられた。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2020-04-01 - 2023-03-31

【配分額】4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)

【研究領域課題番号】20H03180 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソーム / tRNA分子擬態タンパク質 / タンパク質合成 / 翻訳終結 / 品質管理 / 分子遺伝学 / キーワード / リボソーム再生

【研究成果の概要】

本年度、分子遺伝学手法の特性などを考慮し計４年間で実施する研究の第二年度として、計画【1】の分子遺伝学的解析のパイロット実験から更に進んだ候補因子の同定に成功した。また、計画【2】の実践投入の予備的実験を踏まえた実験計画を継続して行なった。
【１】翻訳終結状態を識別する分子機構の分子遺伝学解析。
分子遺伝学的手法（forward/reverse genetics法）で、tRNA擬態蛋白質が関わる翻訳終結機構・蛋白質合成品質管理機構をモニターするアッセイ株の構築を行い、関連する新規因子およびその機能部位探索を実施した。得られた因子の既知因子（ASC1, S20等）については、Hel2相互作用ドメインの解明とその機能モデルを構築することができた（現在論文投稿中）。一方、新規な因子も同定され、その変異体がクラスターする領域を同定しつつある。
【２】 mRNA上の翻訳終結のための因子群の動態を可視化する新規手法開発
本研究計画では、正常・異常翻訳終結にかかわる因子群にRNA編集酵素を融合した因子を細胞内に導入することで、mRNA遺伝暗号読み枠上のどのような領域（配列コンテキストや、5’CAP-mRNA-polyA tail構造上の相対位置）でリボソームにアクセスするかを細胞全体のトランスクリプトーム上にマップすることができる。本年度は、昨年度につづき、目的タンパク質を用いたmRNA-seq解析に必要な遺伝子コンストラクト、発現系の構築を引続き進め、NGSによる解析のためのサンプル調整を試行錯誤した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2020-04-01 - 2024-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究領域課題番号】18K06054 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳 / 哺乳類ミトコンドリア / リボソーム / 新生ペプチド鎖 / ミトコンドリア / タンパク質合成 / ペプチドトンネル / cryoEM

【研究成果の概要】

本研究は、ミトコンドリアリボソームのペプチドトンネルの構造を明らかにし、新生ペプチド鎖とペプチドトンネルの相互作用について知見を得ることを目指すものである。哺乳類ミトコンドリア翻訳系を再構築し、連続プロリン配列を介した翻訳停止を利用して新生ペプチド鎖リボソーム複合体(ribosome-nascentchain complex, RNC)を形成することに成功した(Lee, 2021)。新生ペプチド鎖の長さについて検討したところ、新生ペプチド鎖の長さが約80アミノ酸以上でそのN末端がミトコンドリアリボソームのペプチドトンネルの外に露出することが明らかになった。

【研究の社会的意義】

近年、ミトコンドリアのリボソームや翻訳因子に誤作用して副作用をもたらす薬剤が多く報告されている。また、リボソームのペプチドトンネルは、新生ペプチド鎖のプロセシングや折りたたみ、細胞内輸送などの制御をになう場であり、ペプチドトンネルは多くの抗生物質の結合部位となっている。本研究により、新生ペプチド鎖の配列や長さを制御しながらミトコンドリアのRNCを調製することが可能になった。今後様々なRNCの構造を決定することにより、薬剤デザイン等に有用な知見が得られると期待される。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2021-03-31

【配分額】4,550千円 (直接経費: 3,500千円、間接経費: 1,050千円)

【研究分野】細胞生物学

【研究領域課題番号】16K07342 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

プロテアソーム / リボソーム / 複合体形成 / タンパク質分解 / タンパク質合成 / 出芽酵母

【研究成果の概要】

プロテアソームに関連する新しい遺伝子として出芽酵母TIF6を単離した。Tif6はリボソーム合成に関わる遺伝子である。TIF6の変異体は１）アミノ酸アナログ感受性、２）プロテアソームによって分解されるモデル基質の分解遅延、３）プロテアソーム変異との二重変異による合成増殖遅延を示す。Tif6は保存性の高いタンパク質でヒトのオルソログはeIF6である(70%以上同一)。そこでeIF6とプロテアソームとの関係を調べてみると、eIF6のノックダウンによりプロテアソーム形成が阻害されることがわかった。またeIF6とプロテアソームサブユニットのいくつかは酵母ツーハイブリッド法で結合することが示唆された。

【研究の社会的意義】

細胞内における選択的なタンパク質分解のためのマシナリーであるプロテアソームとタンパク質合成のためのマシナリーであるリボソームとがTif6/eIF6を介して関連している可能性を示唆した。Tif6/eIF6は60Sリボソームの形成に関わるシャペロンであると同時に、80Sリボソーム形成においてチェックポイント機能を果たす分子でもあることが知られていた。Tif6/eIF6の発現減弱細胞はさらにプロテアソーム形成にも異常を示し、またプロテアソームサブユニットとも相互作用することが今回明らかとなり、タンパク質合成とタンパク質分解が協調している可能性を示した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)

【研究分野】神経生理学・神経科学一般

【研究領域課題番号】15K14311 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質合成 / 翻訳 / リボソーム / 神経 / 形態 / レポーター / GFP

【研究成果の概要】

本研究においては、神経の可塑性に関連すると考えられている細胞内タンパク質合成活性の変動を直接捉えることができるレポータータンパク質の開発を行った。測定時のシグナル強度がタンパク質合成を直接反映するように、タンパク質合成中のみに蛍光を発し、合成後に自己消化して消光するような人工レポータータンパク質を設計し、実際に自己消化機構が働くことを確認した。自己消化の効率を上げるためにリンカーの長さや、プロテアーゼ断片の配置や、蛍光タンパク質への変異導入などを行い、最適化を行った。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2015-04-01 - 2017-03-31

【配分額】3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】15KK0250 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質合成 / ミトコンドリア / クライオ電子顕微鏡観察 / リボソーム / 分子生物学 / 低温電子顕微鏡

【研究成果の概要】

様々な哺乳類ミトコンドリア翻訳伸長リボソーム複合体のCryoEM構造解析に取組み、渡航期間中にPRE-recycling複合体(mtRRFmt/55S)と POST-recycling複合体(mtRRF/mtEF-G2・GDPNP/39S)の構造を高分解能で決定した。ミトコンドリアにおけるリボソームリサイクリングの分子機構、リサイクリングとトランスロケーションにおけるEF-Gの作用機序、等の知見が得られた。ミトコンドリアリボソームと翻訳因子の複合体の構造について世界で初めての報告であり、薬剤デザインなどの医療応用にも直ちに結びつく成果である。

【研究種目】国際共同研究加速基金(国際共同研究強化)

【研究期間】2015 - 2017

【配分額】12,220千円 (直接経費: 9,400千円、間接経費: 2,820千円)

【研究分野】生物分子化学

【研究領域課題番号】26220205 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

RNA修飾 / tRNA / リボソーム / タンパク質合成 / マススペクトロメトリー / エピトランスクリプトミクス / RNA修飾病 / tRNA, mRNA, rRNA / RNAマススペクトロメトリー / tRNA修飾 / f5C修飾 / 遺伝暗号の解読 / ht6A修飾 / ミトコンドリアタンパク質合成系 / pre-tRNA capping / N4アセチルシチジン / rRNA

【研究成果の概要】

本研究はRNA修飾が関与する生命現象を明らかとすることを目的とした。主な成果として、mRNAにおけるキャップ依存的な新規m6Aメチル化酵素の発見、酢酸イオンを基質とするRNAアセチル化酵素の発見、炭酸ガスに敏感なtRNA修飾とワールブルク効果との関係、メタボライト濃度に応じて変動するtRNA修飾、tRNA前駆体におけるキャップ修飾の発見、リボソームのアッセンブリーを司るrRNAメチル化修飾、5ホルミルシチジン修飾の生合成などが挙げられる。これらの知見はRNA修飾が担う機能的かつ生理的な役割の理解に大きく貢献するものである。

【研究の社会的意義】

本研究において、私たちは、RNA修飾が関与する生命現象の理解とその分子機構を探求している。特に、RNA修飾が欠損することがヒトの疾患の原因となることを世界で初めて示し、RNA修飾病（RNA modopathy）という疾患の新しいカテゴリーを提唱した。ヒトのミトコンドリアtRNA修飾の生合成機構を研究する過程で、tRNA修飾の欠損がミトコンドリア病の原因であることを突き止め、具体的な治療法や創薬のための基盤的知見を提供している。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2014-05-30 - 2019-03-31

【配分額】195,260千円 (直接経費: 150,200千円、間接経費: 45,060千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】25291020 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソーム / 翻訳制御 / 遺伝暗号 / 直行性 / タンパク質合成 / tRNA擬態タンパク質 / 翻訳終結 / mRNA品質管理 / 直交性

【研究成果の概要】

真核細胞におけるtRNA擬態分子複合体の機能インターフェース解明を行った。まず、出芽酵母では不活性な異種eRF3を用いた変異体分離と解析を行い、tRNA擬態分子eRF1とeRF3およびリボソームとの分子間機能相互作用部位を同定した。次に、リボソーム上でのeRF1によるコドン特異的認識機構の解明のために、保存性eRF1-L123アミノ酸残基の網羅的変異体解析を行った。その結果一連の変異体は、一残基部位のみの変異で新規な終止コドン認識パターンを示した。eRF1とリボソームとのドッキングモデルから、この残基がリボソーム遺伝暗号解読部位のRNA機能残基との相互作用により機能することが示唆された

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】18,070千円 (直接経費: 13,900千円、間接経費: 4,170千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】23657071 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質合成 / tRNA分子擬態 / 遺伝暗号 / mRNA品質管理 / Gタンパク質 / リボソーム / 翻訳終結 / 翻訳調節 / タンパクs質合成

【研究成果の概要】

我々は遺伝暗号解読ならびにmRNA品質管理機構におけるtRNA 擬態分子の性質を明らかにするために以下の研究を行った。１．万能型古細菌aEF1αとtRNA擬態分子との新規複合体結晶構造解明と生化学解析、２．新たな遺伝学系の構築と解析。その結果、tRNA擬態分子複合体形成に関わる結合インターフェースの新知見、ならびに、tRNA分子のアンチコドンループに擬態するtRNA擬態分子のコドン認識部位の極近傍に存在する新たな機能部位などを明らかにすることができた。これらの新規な機能領域はリボソームの遺伝暗号解読機構や、mRNA品質管理機構において翻訳GTPaseスイッチによる制御に関わるものと考えられる。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】22310134 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳終結 / リボソーム / tRNA / 分子擬態 / ペプチド鎖解離因子 / 遺伝暗号解読 / タンパク質合成 / ペプチド鎖解離因

【研究成果の概要】

我々はtRNA擬態分子である真核生物(古細菌)解離因子による終止コドンの解読制御機構を明らかにするために、古細菌由来因子による単体・複合体結晶構造に基づく分子機構解明を行った。その結果、古細菌の翻訳系では、伸長因子aEF1αがtRNAに加え、解離因子aRF1および古細菌Pelotaと結合機能する新事実を明らかにした。この知見は全ての遺伝暗号解読段階においてGTP結合因子のリボソーム上での普遍的な作用機構を示唆する。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】19,630千円 (直接経費: 15,100千円、間接経費: 4,530千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】17310123 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳終結 / 翻訳制御 / リボソーム / リコーディング / ペプチド鎖解離因子 / タンパク質合成 / tRNA分子擬態 / 遺伝子発現制御 / 蛋白質合成

【研究成果の概要】

翻訳終結の触媒中心タンパク質因子であるペプチド鎖解離因子について以下の研究成果公表した。
(1)tRNA擬態タンパク質eRF1のコドン識別機能ドメインの解明のため、終止遺伝暗号を普遍遺伝暗号として用いない例が多く見られる繊毛虫類に由来するeRF1ホモログを用いた比較解析を進めた。今回は、近縁種中、普遍遺伝暗表と一致する終始遺伝暗号を持つ事が予想されたLitostomatea属由来のeRF1のクローンを取得し、そのeRF1によるコドン特異性を、既に確立した酵母・ヒト由来因子とのキメラ体構築技術と、新規に開発したin vivo終始コドン効率測定系を応用し実証した。これらの比較機能解析により、従来のコドン認識領域に関する知見の絞り込みが可能になったと同時に、繊毛虫類には、終止コドンについて、普遍遺伝暗号を用いる系統が混在する事実も明らかになった。
(2)tRNA擬態タンパク質eRF1と共役し機能するペプチド鎖解離因子eRF3に相互作用することが網羅解析から報告されていた因子群について、その作用機構を系統的解析する遺伝学的実験系の構築を行った。各因子について、機能制御の有無や、互換機能性を検証したところ、正負にそれぞれ機能制御する出芽酵母因子SlaIおよびItt1を同定し、これらの機能制御が未知のタンパク質安定化機構とのカップリングを実現している事を明らかにした。不安定化機構を明らかにする目的で、ユビキチンによるプロテアソームや、オートファジー系の細胞内タンパク質分解機構の阻害剤や変異体株を用いた解析を行い、後者がこの分解に主に関わることを示唆する実験結果を得た。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】17,430千円 (直接経費: 15,600千円、間接経費: 1,830千円)

【研究分野】寄生虫学(含衛生動物学)

【研究領域課題番号】17590368 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

寄生性線虫 / ミトコンドリア / タンパク質合成 / 機能性RNA / リボソーム / tRNA / EF-Tu / 線虫

【研究成果の概要】

多細胞動物のミトコンドリアのタンパク質合成系は、様々な点で真核生物の細胞質や原核生物のタンパク質合成系と異なる特徴を持つ事が明らかになってきた。その中で、線形動物ミトコンドリアのタンパク質合成系は、多細胞生物の中で最短のtRNAセットと最小クラスのリボソームRNAを持つ事が、その遺伝子配列から予測されていた。そこで、タンパク質合成系の機能性RNAが縮小化した際、どのような影響が生じるのかという点が明らかにするため、われわれは寄生性線虫および自由性生活性線虫のミトコンドリアタンパク質合成系を解析してきた。本研究では、これをさらに発展させると共に、このような機能性RNAの縮小化がなぜ起きるのかにも迫った。2年間の主な成果は以下のとおりである。
1.細胞内に微量しか存在すしないミトコンドリアリボソームを、効率よく、高純度に調製するために、タグ付きミトコンドリアリボソームタンパク質を発現する組換え線虫を作製した。この線虫内ではタグつきタンパク質がミトコンドリアに移行し、リボソームに取り込まれていることが示唆された。しかし、現在用いているタグ配列に対するアフィニティ精製では高純度のリボソームを得ることができなかった。複数種のタンパク質とタグ配列の組み合わせを検討する必要があると考えられる。
2.自由生活性線虫Caenorhabditid elegansミトコンドリアEF-Tu2のアミノアシル基特異性をもたらす領域を、高度好熱性細菌のEF-TuにEF-Tu2の配列を移植していくことで明らかにした。
3.旋毛虫ミトコンドリアEF-TuのアミノアシルtRNAに対する結合能を明らかにした。
4.節足動物ミトコンドリアEF-TuのアミノアシルtRNAに対する結合能を明らかにした。
5.新規tRNAメチル基転位酵素候補を同定した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2005 - 2006

【配分額】3,600千円 (直接経費: 3,600千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】15310145 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳終結 / 翻訳制御 / リボソーム / リコーディング / ペプチド鎖解離因子 / 蛋白質合成 / tRNA分子擬態 / 遺伝子発現制御

【研究成果の概要】

真核生物ペプチド鎖解離因子eRF3のX線構造決定と高次構造に基づく機能検証を行った。真核生物ペプチド鎖解離因子eRF3は、tRNA擬態性タンパク質であるペプチド鎖解離因子eRF1と結合することで、協調的に翻訳終結反応を遂行するGTP結合タンパク質であり、かつ一方で翻訳終結効率の制御と、細胞内での様々な生理機構を担う因子群との対応を行うハブとして位置づけられる要分子である。解明されたX線結晶構造はGTPおよびGDPの2つのモードに対応するものであり、これらの比較からeRF3がこれまでに明らかにされたGTP結合タンパク質とは異なる新規な機能モードを保持するタンパク質である新事実が明らかになった。また、eRF1との結合領域を高次構造上で推定し実証することで、tRNA擬態タンパク質であるeRF1が、実際にGTP結合タンパク質との相互作用においてもtRNA結合モードを擬態していると言う新知見が明らかになった。
翻訳終結過程におけるリボソーム再生反応に共同で機能する、リボソーム再生因子(RRF)および、伸張因子EF-Gの機能解析を詳細に行った。まず、これまでに明らかにしたEF-GのtRNA擬態領域との相互作用によるRRF機能発現機構に加えて、EF-G tRNA擬態領域によるtRNA転座活性(tRNA translocase)機能との機能相関性をin vivoおよび、in vitroで検証した。tRNA転座活性に著しい欠損を示す点変異(H583K)を導入した変異型大腸菌EF-Gタンパク質は、in vivo、in vitro双方のアッセイ系において全く正常にリボソーム再生反応を触媒することを実証した。tRNA転座反応とRRFとの機能協調性は相関しないというこの新知見はこれまで部分的な実験から提唱されていた逆の趣旨の定説をより強固に覆すものであり、リボソーム再生機構におけるRRFの機能性について新たな方向性を切り開く事となった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】15,900千円 (直接経費: 15,900千円)

【研究分野】神経解剖学・神経病理学

【研究領域課題番号】14580735 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

筋萎縮性側索硬化症 / ALS / 脊髄 / 前角細胞 / リボゾーム / 粗面小胞体 / 蛋白合成 / 蛋白折り畳み / RNA / 転写活性

【研究成果の概要】

本研究において、リボゾーム(r)RNA遺伝子の転写活性の減少は運動ニューロン障害の極めて早期に生じる変化であり、それは細胞内リボゾームRNAを減少させることによって細胞の変性と死に密接に関連していることを明らかにした。また運動ニューロンの変性時には、分子シャペロンの細胞内の局在が早い段階で変化することも示し、粗面小胞体の変化と、それに付着したリボゾームが減少していることも示した。これらは運動ニューロン内の蛋白合成系のステップであり、ALSでは合成系の最上流と考えられるから下流域まで、変性が生じていることを明らかにした。ただ本研究では、これらの変化が、最上流と考えられるrRNA遺伝子転写活性の減少から玉突き式に生じた一連の変化であるのか、個々の流域でそれぞれ別個な原因による変化が生じて、それらがたまたま一列に並んだのか、という区別は出来なかった。今後は、このことを明らかにする必要がある。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2002 - 2004

【配分額】3,500千円 (直接経費: 3,500千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】13480206 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳終結 / 翻訳制御 / リボソーム / リコーディング / ベプチド鎖解離因子 / 蛋白質合成 / tRNA分子擬態 / 遺伝子発現制御 / 翻訳抑制 / ペプチド鎖解離因子

【研究成果の概要】

tRNA擬態性蛋白質について、昨年までの研究成果を発展させることで新たに以下の知見を得た
原核生物ペプチド鎖解離因子上に、昨年までに同定したペプチドアンチコドン機能制御領域である"ドメインC"は、近年明らかにされたペプチド鎖解離因子の立体構造上、実際に、ペプチドアンチコドンに近接するドメインであることが明らかになった。既に公表した機能変異部位が、このドメインの特定の側面部位に局在することから、この領域がリボソーム上でペプチドアンチコドン部位を定位させることで、コドン認識・識別を正確に行うという機能モデルを公表した。
真核生物ペプチド鎖解離因子のコドン識別機能ドメインを特定する為に、既知の立体構造情報を応用し、通常の3つの終止コドン(UAA・UAG・UGA)を認識する出芽酵母由来eRF1と、例外的な終止コドン(UGAのみ)を用いるテトラヒメナ由来のeRF1とのドメインごとのキメラ体産生遺伝子をデザインした。このキメラ体蛋白質および、同蛋白質に、系統的な変異導入を行った変異体のin vivoおよび、in vitro解析結果により、ドメインIがコドン特異性を決定することを明らかにした。
また、翻訳終結過程の最終段階であるリボソーム再生過程における、伸長因子EF-Gと、リボソーム再生因子との相互作用ドメインを系統的な遺伝学手法と、生化学手法により検索した。その結果、リボソーム再生因子との相互作用部位として、EF-GのtRNA擬態領域であるドメインIV-Vの立体構造上の特定の領域に局在するアミノ酸残基群を特定した。
以上の、研究成果により、「解離因子-tRNA擬態仮説」の具体的な実証を進めつつ、さらに、翻訳終結に関わるその他の蛋白質群が、tRNA擬態性ドメインを有効な機能領域として用いている事を明らかにできた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】15,200千円 (直接経費: 15,200千円)

【研究分野】生物有機科学

【研究領域課題番号】08878083 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソーム / rRNA / リボザイム / tRNA / 蛋白質合成 / RNA / ペプチジルトランスフェラーゼ

【研究成果の概要】

生命に誕生において、まずRNAのみからなるRNAワールドが原始地球上に存在し、その後このRNAワールドに蛋白質が取り込まれたするシナリオが有力なものになりつつある。しかし、この蛋白質の取り込みについての道筋に関してはなんら説得力のある仮説は提唱されていない。本研究は、このプロセスについて、現在の生物の分子機構の解明を基盤としてアプローチした。
蛋白質の合成は、現在の生物では、巨大な蛋白質-RNA複合体であるリボソームで行われるが、そのペプチド鎖形成反応を行う分子(ペプチジルトランスフェラーゼ)が、リボソーム蛋白質であるのか、リボソームRNAであるのかは、未だ不明である。1992年に、H.Noller(米)のグループは、除タンパク処理を行ったリボソームでもペプチド鎖形成反応をすることを見いだしたが、この除タンパク処理は不十分であり、RNAがペプチジルトランスフェラーゼ活性を持つという結論には到達できなかった。本研究では、まずリボソームRNAを試験管内での転写反応によって合成し、完全に蛋白質のないシステムを構築した。このシステムを用いて、様々な条件を検討した。その結果、23SリボソームRNAの構造を組み直すフォールディング処理を行い、また界面活性剤であるSDSを添加することにより、ペプチジルトランスフェラーゼ活性を発現させることに成功した。この結果は、リボソームRNAがペプチジルトランスフェラーゼそのものであることを示す最初の実験的証拠となった。また,リボソームRNAの蛋白質合成活性の発現の反応機構を詳細に検討した。その結果,リボソーム同様に二つ以上のtRNA結合部位を持つこと,またtRNAはtを適切な位置に固定することにより,自発的な反応を引き起こすことを,明らかにした。これらの研究は,RNAワールドから蛋白質合成系が誕生する過程を明らかにする上で,重要な知見となるものと期待される。

【研究種目】萌芽的研究

【研究期間】1996 - 1997

【配分額】2,200千円 (直接経費: 2,200千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】08044196 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質合成 / 翻訳終結 / 終止コドン / ペプチド鎖解離因子 / 分子擬態 / tRNA / リボゾーム / 高度好熱菌 / ペプチド鎖解難因子 / tRMA / リボソーム / テトラヒメナ / 遺伝子発現の転写後調節

【研究成果の概要】

タンパク質合成(翻訳)の終結機構の研究は、2つの点で重要である。第1に、遺伝暗号の解読機構は1970年前にその基本機構が完全に解明されたと理解されているが、その認識は誤りである。翻訳終結については、(1)終止コドンの認識、(2)23S rRNAのリボザイムによるペプチド鎖の切断、(3)リボソーム複合体の最終解離、等の基本的な問題が分子レベルで未解決である。第2に、終止コドンは翻訳の停止信号とならない事例が生物種を問わず数多く発見されている。フレームシフトやアミノ酸の読み替え等、暗号解読の普遍則から外れた翻訳現象が、リコーディング機構と命名されて、翻訳研究のフロンティアとなっている。終止コドンで翻訳を、「止めるべきが、止めざるべきが」、それが問題となるようになってきたのである。さらに、翻訳終結の効率を調節することによる遺伝子発現の制御システムの存在も明かになってきた。このような理由がら、「終止コドンの認識→プペチド鎖切断→リポソーム複合体の解離」に至る翻訳終結の基本的な分子機構に関する研究を、大腸菌および酵母のモデル系で優先的に実施する必要性から、本研究を行った。終止コドン認識に関する研究のブレークスルーは、翻訳調節に働く一群のタンパク質が、核酸であるtRNAの構造とそっくり、という「分子擬態」の発見である。我々は、終結に働く解離因子がアンチコドンをも擬態し終止コドンを認識すると考え、分子擬態(molecular mimicry)仮説を提出した。タンパク質とRNAの分子擬態は、生物学にとって新しい概念であり、生命がRNAワールドがらタンパク質(DNA)ワールドへと進化してきたことを考えれば、生命の根幹に係わる基本的な原理のひとつと考えられる。この研究は、基礎生物学に役立つのみならず、バイオテクノロジーに新たな技術を生み出すチャレンジともいえる。現在、分子擬態の基盤原理の解明とともに、タンパク質による遺伝暗号の解読という新しい領域を確立する方向へ研究を進めている。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】35,700千円 (直接経費: 35,700千円)