【研究領域課題番号】20K20376 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脂質二重膜 / X線結晶解析 / 膜蛋白質 / 結晶 / 結晶解析 / 結晶大型化 / 構造生物学

【研究成果の概要】

膜蛋白質の真の構造生物学を目指し、「脂質二重膜からプロトンまで」の全てを可視化する技術の開発に取り組んでいる。第一の目標は膜蛋白質結晶中の脂質二重膜の可視化であり、具体的課題は分解能10Åよりも低角の反射点の位相決定である。溶媒コントラスト変調法の拡張と多重同型置換法、その両者の組み合わせの適用を考え、技術開発とデータ収集を行った。さらに、中性子回折への発展を考え、膜蛋白質の大型結晶の作製技術の開発を試みた。

【研究の社会的意義】

本研究の結果、低角反射に対する位相決定技術が拡充され、既に実績のある溶媒コントラスト変調法に関しても適用できる結晶が大幅に拡大した。その結果、これまでX線結晶解析が機能しないためにごく限られた知見しかない、燐脂質と膜蛋白質との相互作用の詳細を明らかにすることが可能になった他、蛋白質結晶中で熱運動が大きくて解像できなかった糖鎖等も解像できるようになった。クライオ電子顕微鏡法では燐脂質頭部が解像されないことが多いため、本研究で開発した技術との組み合わせも追及されるべきであろう

【研究種目】挑戦的研究(開拓)

【研究期間】2020-04-01 - 2022-03-31

【配分額】25,610千円 (直接経費: 19,700千円、間接経費: 5,910千円)

【研究領域課題番号】18K06079 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物化学 / X線結晶構造解析 / ABC輸送体 / 膜蛋白質 / 薬剤耐性 / 構造生物学 / 輸送タンパク質 / X線結晶解析 / 膜輸送体

【研究成果の概要】

本研究では、ATPを利用して基質を能動輸送するATP-binding cassette（ABC）輸送体のうち、外膜チャネルと膜融合蛋白質と複合体を形成して基質の輸送を行う三者複合体形成型輸送体MacBについて、その基質輸送機構を解明することを目的とした。2017年に我々は分解能3.4オングストロームでMacBの結晶構造を明らかにしたが、本研究では新たに別のMacBホモログで分解能2.0オングストロームのより精密な構造解析に成功した。さらに複数の別条件の結晶からも構造を得た。それらの構造を比較することにより、MacBの構造変化が観察され、基質輸送機構の理解につながる新たな知見が得られた。

【研究の社会的意義】

本研究の対象であるMacBは、マクロライド系抗生物質やペプチド毒素、リポ多糖等の生物学的に重要な物質の排出に関与しており、その排出機構を解明することは、創薬のみならず生命現象の理解という観点からも非常に有用な情報が引き出せると期待される。本研究で明らかとなったMacBの構造変化は、従来のABC輸送体とは大きく異なるものであった。これらの結果から、詳細が解明されていないMacBを含むVII型ABC輸送体の基質輸送の分子機構について、新たなモデルを提唱した。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2018-04-01 - 2022-03-31

【配分額】4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】11308026 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

能動輸送 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 電子線結晶解析 / X線結晶解析 / ATPase

【研究成果の概要】

本研究の目標は筋小胞体カルシウムATPaseの三次元構造をまずは、既に薄いながらもX線レベルの三次元結晶が得られていたカルシウム結合状態(ElCa^<2+>)の結晶を用いて、原子分解能で決定し、さらに他の生理的状態に関しても結晶化を進めることであった。本研究は我々の期待を上回る速度で進行し、3つの状態について原子モデルを構築でき、さらに他の2つのカルシウム結合状態(E1ATPとE1Pのアナログ)についても結晶化に成功している。この結果、カルシウムと燐酸の離脱に伴う構造変化を明らかにすることが出来た。すなわち、カルシウムの離脱に伴い10本ある膜貫通ヘリックスのうち、6本が大きな再配置を起こし、カルシウム結合時には大きく離れていた三つの細胞質ドメインはコンパクトに集合することが判明した。膜貫通ヘリックスのうち2本は、膜に対し垂直方向の運動成分を持ち、カルシウムの離脱・結合に伴って、ピストンのように運動すること、すなわちP型イオンポンプは原子サイズの手押しポンプのような機構を持っていることが明らかとなった。その成果の一部は2000年6月と2002年8月にNatureに、2002年12月にPNASに発表することが出来た。
以上の成果は世界的注目を集め、NatureやNature Structure BiologyのNew ＆ Views、ScienceのEditor's choiceで詳しく紹介された他、世界標準の生化学、分子生物学の教科書に最近の大きな成果として紹介されている。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】1999 - 2001

【配分額】31,110千円 (直接経費: 30,600千円、間接経費: 510千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】10044198 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

能動輸送 / 蛋白質結晶 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / 大量発現 / 電子線結晶解析 / X線結晶解析 / ATPase

【研究成果の概要】

本研究の目的はP型イオンポンプによる能動輸送のメカニズムを構造面から理解しようとするものであった。計画立案時には、結晶が小さく、電子顕微鏡による解析しか不可能であったが、X線結晶解析に適用しうる三次元結晶の作製に成功したため、将来の発展を考え、部位特異的変異体の構造解析のための準備に重点を置くことにした。そのため、アデノウイルスによる発現系を用いてカルシウムATPaseの大量生産に成功している、米国メリーランド大学イネシ教授との共同研究を中心に据えた。カルシウムATPaseは分子量11万の膜蛋白質であるため、同教授グループしか構造解析に必要な量の産生に成功しているグループはないからである。この目的のために、代表者が一度渡米、イネシ教授側が3度来日して、研究の打ち合わせを行った。特に問題となったのは、培養細胞からの抽出精製方法である。イネシ教授側の最初の来日時に、代表者が結晶化の為に改良してきた精製法を収得して貰い、培養細胞系に適用した。その結果、従来の色素カラムによる精製方法では、純度の点で不十分であることが判明したため、改良を検討している。また、カルシウム存在下の構造に関し高分解能でのX線結晶解析がほぼ終了したため、その結果をイネシ教授側が行ってきた、カルシウム結合に関与した部位特異的変異体を用いた実験結果の解釈に利用することが出来た。これらの実験は相補的であり、大変有意義な成果をもたらした。この結果は共同の論文として、現在投稿中である。また、この過程で、共同で総説を書くことが出来た(印刷中)。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1998 - 1999

【配分額】4,700千円 (直接経費: 4,700千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】09480171 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イオンポンプ / 筋小胞体 / 能動輸送 / 三次元構造 / 電子顕微鏡 / 構造解析 / 膜蛋白質 / X線結晶解析

【研究成果の概要】

本研究では能動輸送の構造的基盤を解明するために、P型イオンポンプを代表する筋小胞体カルシウムATPaseを対象として、電子線・X線構造解析を行った。この膜蛋白質は本研究を開始した時点で、電子線で解析可能な2つの形態の結晶を作ることが知られていた。すなわち、カルシウムイオン非存在下小胞体膜そのものが変形してつくるチューブ状結晶と高濃度カルシウムイオン存在下で再構成膜がつくる三次元微結晶である。チューブ状結晶に関してはさらにATPの非加水分解アナログである。クロミウムATPを結合した状態でもチューブ状結晶をつくることを見出し、米国グループとの共同研究になる阻害剤thapsigarginを結合した状態とあわせるこの状態の構造を8A分解能で解析した。これによって膜内の二次構造やATPの結合部位が明らかになり、結果の一部分はNature,Biophys J に報告した。また、そのために広範なプログラムを開発した(投稿準備中)。一方、高濃度カルシウム存在下の三次元結晶の膜と平行な2回回転軸(b軸)方向の投影像を得、チューブ状結晶からの三次元構造と比較したところ、分子全体で大きな構造変化があることが判った(Biophys J に発表)。さらに、結晶化条件を改良した結果、薄いながらも良質の板状三次元結晶を得ることに成功した。ごく薄いものは電子線で、厚いものはX線で解析できることがわかった。電子線用の回転カメラと解析ソフトウェアを開発した結果、格子定数は電子線用のごく薄いものもX線結晶解析に用いたものとほぼ同一であることがわかった。そこで電子顕微鏡像による位相の収集に取り組み、部分的ではあるが大変有用な位相情報が得られた。現在、重原子同型置換体の探索を行っている。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】1997 - 1998

【配分額】13,800千円 (直接経費: 13,800千円)

【研究分野】広領域

【研究領域課題番号】06305006 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

蛋白質 / X線結晶解析 / 蛋蛋白質 / 糖蛋白質 / 抗体 / 結晶化 / 三次元構造 / 構造生物学 / X線結晶構造解析 / 膜蛋白質 / 蛋白質三次元構造 / 結晶構造 / 生体高分子 / X線回折法 / 分子生物学

【研究成果の概要】

蛋白質の機能の解明と応用の研究を進展させるため、蛋白質の三次元構造の研究の分担を通じ、X線結晶解析の方法の新展開と、蛋白質の機能構造の迅速な研究体制の構築を本研究の目的とした。
平成6〜7年度の計画として、1 アミノ酸改変蛋白質、2 各種プロテアーゼとその阻害剤との複合体、3 アミラーゼ等とその阻害蛋白質、4 核酸および核酸を認識する蛋白質、5 抗原を認識する抗体と抗原複合体 6 膜蛋白質、結晶化法、7 ウイルス等の巨大分子単位、その直接解析法、8 アミノ酸改変蛋白質の産製と迅速解析法、9 高速高精度なX線回折データ測定法、10 X線異常分散を利用する解析法、11 迅速な自動分子置換構造解析システムの構築、12 糖蛋白質の結晶化と解析の手法、13 溶液NMR情報を用いるX線解析法など、蛋白質構造の解析と、新解析手法の開発と構築に関する研究を行い、これらに関する成果を得た。
研究の成果として、系統化した結晶化法と結晶化用の試料調製法に基づいて、膜蛋白質bovine cytochrome coxidaseと糖蛋白質human renal dipeptidaseの解析に成功した。高精度データ測定の装置システムとソフトウェアCa等の異常分散効果の利用法、多波長異常分散法による直接解析法、自動分子置換解析法などを開発・構築したキメラ酵素の作成とその構造の解析、酵素の耐熱化の機構の研究、トリプシン族の酵素とその阻害剤との複合体の解析、解糖系等の酵素およびその阻害蛋白質の解析、抗体のFvとFabのフラグメントと抗原ハプテンとの複合体の解析などを行ない、成果を公表した。
方法論的展開と研究者間の連携と協力をはかる研究の骨子を達成するため、公開の研究会を2回開催し、研究の進捗と成果を取りまとめた研究中間報告書を6年度に、さらに、研究成果報告書を7年度に印刷し、配布した

【研究種目】総合研究(A)

【研究期間】1994 - 1995

【配分額】9,300千円 (直接経費: 9,300千円)