【研究領域課題番号】20K20376 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

脂質二重膜 / X線結晶解析 / 膜蛋白質 / 結晶 / 結晶解析 / 結晶大型化 / 構造生物学

【研究成果の概要】

膜蛋白質の真の構造生物学を目指し、「脂質二重膜からプロトンまで」の全てを可視化する技術の開発に取り組んでいる。第一の目標は膜蛋白質結晶中の脂質二重膜の可視化であり、具体的課題は分解能10Åよりも低角の反射点の位相決定である。溶媒コントラスト変調法の拡張と多重同型置換法、その両者の組み合わせの適用を考え、技術開発とデータ収集を行った。さらに、中性子回折への発展を考え、膜蛋白質の大型結晶の作製技術の開発を試みた。

【研究の社会的意義】

本研究の結果、低角反射に対する位相決定技術が拡充され、既に実績のある溶媒コントラスト変調法に関しても適用できる結晶が大幅に拡大した。その結果、これまでX線結晶解析が機能しないためにごく限られた知見しかない、燐脂質と膜蛋白質との相互作用の詳細を明らかにすることが可能になった他、蛋白質結晶中で熱運動が大きくて解像できなかった糖鎖等も解像できるようになった。クライオ電子顕微鏡法では燐脂質頭部が解像されないことが多いため、本研究で開発した技術との組み合わせも追及されるべきであろう

【研究種目】挑戦的研究(開拓)

【研究期間】2020-04-01 - 2022-03-31

【配分額】25,610千円 (直接経費: 19,700千円、間接経費: 5,910千円)

【研究領域課題番号】19H00975 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

構造生物学 / イオンポンプ / カルシウムポンプ / ナトリウムポンプ / 膜蛋白質 / 能動輸送 / 結晶解析

【研究成果の概要】

本研究は、P型ATPase（ポンプ）による能動輸送機構を原子構造に基づいて解明し、究極的には「何故そういう構造が必要なのか」「構造変化を起こす（或いは妨げる）機構はどのようなものか」を理解することを目指している。
最も研究が進んでいる筋小胞体Ca2+ポンプに関しては、特に生理的濃度のCa2+存在下低pHでの結晶構造の解析を進めた。これまでに得られたE1・2Ca2+状態の構造は高濃度（10-100 ｍM）のCa2+存在下で得られたものであり、生理的条件とは著しく異なっていた。また、低pHで安定化されるE2・nH+状態にCa2+が結合したときはH+が結合したままである可能性もあった。得られた構造では、2個のCa2+の配位そのものは高濃度Ca2+存在下の構造と同一であったが、Aドメインは本体から外れており、そのままでは次のステップに行けないことがわかった。すなわち、「自己燐酸化におけるAドメインの役割は何か」「Aドメインが正しい位置にないと何故自己燐酸化は起きえないか」を解明する必要がある。
Na+ポンプに関しては、E1・3Na+状態の構造決定に加え、種々の強心ステロイドとの複合体の結晶構造解析研究の完成に注力した。強心ステロイドは2世紀以上にわたって心不全に対し処方されてきたが、Na+ポンプの強力阻害剤でもあり、使いにくいものであった。そのため、組織特異的な薬剤の開発が待たれていたが、本研究により重要な指針を与えることができた。さらに、予想外であったが、bufalinを結合させた結晶をRb+を含む溶液に浸漬することにより、1個のK+と1個のMg2+を結合した状態を作り得ることが判明し、2個のK+の順序だった結合過程と強心ステロイドによる阻害メカニズムを明らかにすることができた。以上の結果をPNAS誌に報告した。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2019-04-01 - 2022-03-31

【配分額】45,760千円 (直接経費: 35,200千円、間接経費: 10,560千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】16H02499 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イオンポンプ / 膜蛋白質 / 結晶解析 / エネルギー変換 / 構造生物学 / 蛋白質 / 生物物理

【研究成果の概要】

本研究は、イオン能動輸送機構の完全な理解を第一の目標とし、特に、既に10の中間状態の構造決定に成功しているCa2+ポンプを対象に、イオンポンプは「どうしてそういう構造をとる必要があるのか」を追求した。イオン通路のゲート残基の変異体の結晶構造からプロトンの対向輸送の意義を解明し、Ca2+非存在下でATPを結合した状態の結晶から、ATPのみで起こる構造変化を明らかにした。さらに、4状態のCa2+ポンプ結晶中の脂質二重膜の可視化によって構造変化における燐脂質との相互作用の詳細を初めて明らかにした。

【研究の社会的意義】

イオンポンプは生体の恒常性の維持に極めて重要な役割を持つ膜蛋白質であり、心臓病や癌、神経疾患の治療などの観点からも注目されている。Ca2+ポンプに関しては11の中間状態の構造決定に成功しているのみならず、本研究によって構造変化におけるプロトンの役割や脂質二重膜との相互作用の詳細の解明にまで成功した唯一の膜蛋白質である。原子構造に基づく蛋白質の作動機構の理解がここまで進んだ蛋白質は他に無く、学術的価値は極めて高い。

【研究種目】基盤研究(A)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】43,030千円 (直接経費: 33,100千円、間接経費: 9,930千円)

【研究分野】生物物理学

【研究領域課題番号】19107005 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

イオンポンプ / 膜蛋白質 / 結晶解析

【研究成果の概要】

(a)筋小胞体Ca^<2+>-ATPase(SERCA1a)の中間状態の構造決定。ここでは、E2P基底状態のアナログであるE2・BeF_xの構造決定が最初の課題であった。この結晶化には3年以上取り組んで来たが、最近ようやくX線にかかる結晶を得ることができた。分解能の向上に努めた結果、SPring-8でのデータ収集によって2.5〓分解能のデータを得ることが出来、分子置換法によって構造を決定することも出来た。この結果、この複合体では遷移状態の構造と比較して予想以上に大きな構造変化が起こっていることがわかり、燐酸化アスパラギン酸の加水分解と膜内イオン通路の開閉とを結合する機構に関し、重要な知見が得られた。
(b)Ca^<2+>-ATPase(変異体)と薬物複合体の構造決定-特に抗マラリア薬であるartemisinin或いはその派生物との複合体の構造決定。よく知られた抗マラリア薬であるartemisininはウサギ骨格筋Ca^<2+>-ATPaseの野生型には結合しないがE255L変異体には高い親和性を持つ。そこでこの変異体の生産を研究協力者のInesi博士が行い、精製・結晶化を東京で行う計画であった。変異体の場合、出発試料中の含有量がこれまでの1/10程度であるため、精製法の大幅な改良が必要であった。
Hydroxyapatiteを用いることにより、これまでの難点を克服可能であることを見出した。

【研究種目】基盤研究(S)

【研究期間】2007 - 2011

【配分額】40,430千円 (直接経費: 31,100千円、間接経費: 9,330千円)