【研究領域課題番号】20H03180 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソーム / tRNA分子擬態タンパク質 / タンパク質合成 / 翻訳終結 / 品質管理 / 分子遺伝学 / キーワード / リボソーム再生

【研究成果の概要】

本年度、分子遺伝学手法の特性などを考慮し計４年間で実施する研究の第二年度として、計画【1】の分子遺伝学的解析のパイロット実験から更に進んだ候補因子の同定に成功した。また、計画【2】の実践投入の予備的実験を踏まえた実験計画を継続して行なった。
【１】翻訳終結状態を識別する分子機構の分子遺伝学解析。
分子遺伝学的手法（forward/reverse genetics法）で、tRNA擬態蛋白質が関わる翻訳終結機構・蛋白質合成品質管理機構をモニターするアッセイ株の構築を行い、関連する新規因子およびその機能部位探索を実施した。得られた因子の既知因子（ASC1, S20等）については、Hel2相互作用ドメインの解明とその機能モデルを構築することができた（現在論文投稿中）。一方、新規な因子も同定され、その変異体がクラスターする領域を同定しつつある。
【２】 mRNA上の翻訳終結のための因子群の動態を可視化する新規手法開発
本研究計画では、正常・異常翻訳終結にかかわる因子群にRNA編集酵素を融合した因子を細胞内に導入することで、mRNA遺伝暗号読み枠上のどのような領域（配列コンテキストや、5’CAP-mRNA-polyA tail構造上の相対位置）でリボソームにアクセスするかを細胞全体のトランスクリプトーム上にマップすることができる。本年度は、昨年度につづき、目的タンパク質を用いたmRNA-seq解析に必要な遺伝子コンストラクト、発現系の構築を引続き進め、NGSによる解析のためのサンプル調整を試行錯誤した。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2020-04-01 - 2024-03-31

【配分額】17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】16H04760 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソーム / 翻訳制御 / 品質管理 / 遺伝暗号 / 分子擬態 / tRNA分子擬態 / 翻訳終結

【研究成果の概要】

タンパク質合成におけるmRNA遺伝暗号解読には、センスコドンに対するアダプター分子である核酸分子tRNAに加え、翻訳終結コドンの解読や、異常mRNA翻訳中に停滞したリボソームの救済に関わるtRNA擬態タンパク質群が存在している。本研究では、真核細胞とバクテリア双方のtRNA擬態タンパク質の比較解析も平行して行い、真核細胞におけるmRNAシステムにおける、tRNAと協調して機能する伸長因子EF1AのホモログでもあるGTP結合タンパク質Ski7の機能性を実証するとともに、真核生物ではこれまで報告されていなかった解離因子(eRF1/eRF3)が関わるリボソーム救済機構を見いだす事に成功した。

【研究の社会的意義】

mRNAからのタンパク質合成の高次機能発現制御機構の解明は、生命に普遍的な分子機構の理解のみならず、新規機能性タンパク質の人工合成方法の開発や癌をはじめとする多くの遺伝疾患の発症機構の解明や創薬・治療方法の開発に必須な知見となる。本研究成果は、細胞内におけるタンパク質合成におけるリボソームの翻訳反応に関わりその高次機能発現への拡張を可能にするtRNA擬態タンパク質による高次機能発現機構の分子メカニズムの解明により、その医工学的応用研究への手がかりを与えた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2016-04-01 - 2019-03-31

【配分額】17,810千円 (直接経費: 13,700千円、間接経費: 4,110千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】26840001 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

translation / termination / ribosome / mRNA分解 / 翻訳終結

【研究成果の概要】

真核細胞は遺伝情報の維持・発現の過程で生じる異常mRNAを認識・分解する仕組み「mRNA品質管理機構」を備えている。本研究では、高等真核細胞における翻訳終結コドンを欠失したノンストップmRNAの分解機構解明を目的とした。その結果、ノンストップmRNA分解経路がショウジョウバエ細胞にも保存されていること、また、ABCE1（リボソーム解離因子）が関与していることを明らかにした。

【研究種目】若手研究(B)

【研究期間】2014-04-01 - 2016-03-31

【配分額】4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】25291020 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

リボソーム / 翻訳制御 / 遺伝暗号 / 直行性 / タンパク質合成 / tRNA擬態タンパク質 / 翻訳終結 / mRNA品質管理 / 直交性

【研究成果の概要】

真核細胞におけるtRNA擬態分子複合体の機能インターフェース解明を行った。まず、出芽酵母では不活性な異種eRF3を用いた変異体分離と解析を行い、tRNA擬態分子eRF1とeRF3およびリボソームとの分子間機能相互作用部位を同定した。次に、リボソーム上でのeRF1によるコドン特異的認識機構の解明のために、保存性eRF1-L123アミノ酸残基の網羅的変異体解析を行った。その結果一連の変異体は、一残基部位のみの変異で新規な終止コドン認識パターンを示した。eRF1とリボソームとのドッキングモデルから、この残基がリボソーム遺伝暗号解読部位のRNA機能残基との相互作用により機能することが示唆された

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2013-04-01 - 2016-03-31

【配分額】18,070千円 (直接経費: 13,900千円、間接経費: 4,170千円)

【研究分野】構造生物化学

【研究領域課題番号】23657071 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質合成 / tRNA分子擬態 / 遺伝暗号 / mRNA品質管理 / Gタンパク質 / リボソーム / 翻訳終結 / 翻訳調節 / タンパクs質合成

【研究成果の概要】

我々は遺伝暗号解読ならびにmRNA品質管理機構におけるtRNA 擬態分子の性質を明らかにするために以下の研究を行った。１．万能型古細菌aEF1αとtRNA擬態分子との新規複合体結晶構造解明と生化学解析、２．新たな遺伝学系の構築と解析。その結果、tRNA擬態分子複合体形成に関わる結合インターフェースの新知見、ならびに、tRNA分子のアンチコドンループに擬態するtRNA擬態分子のコドン認識部位の極近傍に存在する新たな機能部位などを明らかにすることができた。これらの新規な機能領域はリボソームの遺伝暗号解読機構や、mRNA品質管理機構において翻訳GTPaseスイッチによる制御に関わるものと考えられる。

【研究種目】挑戦的萌芽研究

【研究期間】2011 - 2012

【配分額】3,770千円 (直接経費: 2,900千円、間接経費: 870千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】22310134 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳終結 / リボソーム / tRNA / 分子擬態 / ペプチド鎖解離因子 / 遺伝暗号解読 / タンパク質合成 / ペプチド鎖解離因

【研究成果の概要】

我々はtRNA擬態分子である真核生物(古細菌)解離因子による終止コドンの解読制御機構を明らかにするために、古細菌由来因子による単体・複合体結晶構造に基づく分子機構解明を行った。その結果、古細菌の翻訳系では、伸長因子aEF1αがtRNAに加え、解離因子aRF1および古細菌Pelotaと結合機能する新事実を明らかにした。この知見は全ての遺伝暗号解読段階においてGTP結合因子のリボソーム上での普遍的な作用機構を示唆する。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2010 - 2012

【配分額】19,630千円 (直接経費: 15,100千円、間接経費: 4,530千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】17310123 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳終結 / 翻訳制御 / リボソーム / リコーディング / ペプチド鎖解離因子 / タンパク質合成 / tRNA分子擬態 / 遺伝子発現制御 / 蛋白質合成

【研究成果の概要】

翻訳終結の触媒中心タンパク質因子であるペプチド鎖解離因子について以下の研究成果公表した。
(1)tRNA擬態タンパク質eRF1のコドン識別機能ドメインの解明のため、終止遺伝暗号を普遍遺伝暗号として用いない例が多く見られる繊毛虫類に由来するeRF1ホモログを用いた比較解析を進めた。今回は、近縁種中、普遍遺伝暗表と一致する終始遺伝暗号を持つ事が予想されたLitostomatea属由来のeRF1のクローンを取得し、そのeRF1によるコドン特異性を、既に確立した酵母・ヒト由来因子とのキメラ体構築技術と、新規に開発したin vivo終始コドン効率測定系を応用し実証した。これらの比較機能解析により、従来のコドン認識領域に関する知見の絞り込みが可能になったと同時に、繊毛虫類には、終止コドンについて、普遍遺伝暗号を用いる系統が混在する事実も明らかになった。
(2)tRNA擬態タンパク質eRF1と共役し機能するペプチド鎖解離因子eRF3に相互作用することが網羅解析から報告されていた因子群について、その作用機構を系統的解析する遺伝学的実験系の構築を行った。各因子について、機能制御の有無や、互換機能性を検証したところ、正負にそれぞれ機能制御する出芽酵母因子SlaIおよびItt1を同定し、これらの機能制御が未知のタンパク質安定化機構とのカップリングを実現している事を明らかにした。不安定化機構を明らかにする目的で、ユビキチンによるプロテアソームや、オートファジー系の細胞内タンパク質分解機構の阻害剤や変異体株を用いた解析を行い、後者がこの分解に主に関わることを示唆する実験結果を得た。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2005 - 2007

【配分額】17,430千円 (直接経費: 15,600千円、間接経費: 1,830千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】16570144 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

ノンストップmRNA / mRNA品質管理 / 翻訳終結 / ペプチジル-tRNA / リボソーム / ペプチド鎖解離反応 / 翻訳終結因子 / mRNA品質管理機構 / ナンセンス変異依存分解系 / トランス翻訳 / ノンストップ依存RNA分解機構

【研究成果の概要】

情報を正確に発現する為に、細胞はmRNAの品質を厳密に監視して不良品を速やかに除去するサーベイランス機構を保持している。例えば、終止コドンを含まないmRNA(以下ノンストップmRNA)由来の遺伝子産物を積極的に排除するシステムは、生物種を超えて存在する。原核生物では、トランス翻訳と呼ばれる機構により異常タンパク質が分解される。真核生物においては、ノンストップmRNAを分解する系が最近発見され、3'→5'方向の分解が主要な役割を果たすことが示された。我々は、酵母を材料として真核生物におけるノンストップmRNAの翻訳とmRNA分解機構について解析し、ノンストップmRNAの翻訳抑制と5'→3'方向の分解の関与を明らかにした。また我々は、大腸菌においてノンストップmRNA由来のタンパク質の発現レベルをtmRNA非存在下で検討し、終止コドンを持つmRNAと比較してほぼ同程度であることを見出した。これは、原核生物においてはノンストップmRNAの翻訳が抑制されない為、トランス翻訳による積極的な異常タンパク質の排除機構が必要となる可能性を示唆していた。これらの結果を踏まえ、平成17年度には、大腸菌におけるポリソーム解析を行い、ノンストップmRNAの翻訳効率を直接生体内で解析した。その結果、ノンストップmRNAが正常なmRNAと同様の効率で翻訳されることを明らかにした。これは生体内において、終止コドン非依存の翻訳終結が正常な翻訳終結と同等の効率で起こる事を初めて示したものである。

【研究種目】基盤研究(C)

【研究期間】2004 - 2005

【配分額】3,700千円 (直接経費: 3,700千円)

【研究分野】生物分子科学

【研究領域課題番号】15310145 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳終結 / 翻訳制御 / リボソーム / リコーディング / ペプチド鎖解離因子 / 蛋白質合成 / tRNA分子擬態 / 遺伝子発現制御

【研究成果の概要】

真核生物ペプチド鎖解離因子eRF3のX線構造決定と高次構造に基づく機能検証を行った。真核生物ペプチド鎖解離因子eRF3は、tRNA擬態性タンパク質であるペプチド鎖解離因子eRF1と結合することで、協調的に翻訳終結反応を遂行するGTP結合タンパク質であり、かつ一方で翻訳終結効率の制御と、細胞内での様々な生理機構を担う因子群との対応を行うハブとして位置づけられる要分子である。解明されたX線結晶構造はGTPおよびGDPの2つのモードに対応するものであり、これらの比較からeRF3がこれまでに明らかにされたGTP結合タンパク質とは異なる新規な機能モードを保持するタンパク質である新事実が明らかになった。また、eRF1との結合領域を高次構造上で推定し実証することで、tRNA擬態タンパク質であるeRF1が、実際にGTP結合タンパク質との相互作用においてもtRNA結合モードを擬態していると言う新知見が明らかになった。
翻訳終結過程におけるリボソーム再生反応に共同で機能する、リボソーム再生因子(RRF)および、伸張因子EF-Gの機能解析を詳細に行った。まず、これまでに明らかにしたEF-GのtRNA擬態領域との相互作用によるRRF機能発現機構に加えて、EF-G tRNA擬態領域によるtRNA転座活性(tRNA translocase)機能との機能相関性をin vivoおよび、in vitroで検証した。tRNA転座活性に著しい欠損を示す点変異(H583K)を導入した変異型大腸菌EF-Gタンパク質は、in vivo、in vitro双方のアッセイ系において全く正常にリボソーム再生反応を触媒することを実証した。tRNA転座反応とRRFとの機能協調性は相関しないというこの新知見はこれまで部分的な実験から提唱されていた逆の趣旨の定説をより強固に覆すものであり、リボソーム再生機構におけるRRFの機能性について新たな方向性を切り開く事となった。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2003 - 2004

【配分額】15,900千円 (直接経費: 15,900千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】13480206 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

翻訳終結 / 翻訳制御 / リボソーム / リコーディング / ベプチド鎖解離因子 / 蛋白質合成 / tRNA分子擬態 / 遺伝子発現制御 / 翻訳抑制 / ペプチド鎖解離因子

【研究成果の概要】

tRNA擬態性蛋白質について、昨年までの研究成果を発展させることで新たに以下の知見を得た
原核生物ペプチド鎖解離因子上に、昨年までに同定したペプチドアンチコドン機能制御領域である"ドメインC"は、近年明らかにされたペプチド鎖解離因子の立体構造上、実際に、ペプチドアンチコドンに近接するドメインであることが明らかになった。既に公表した機能変異部位が、このドメインの特定の側面部位に局在することから、この領域がリボソーム上でペプチドアンチコドン部位を定位させることで、コドン認識・識別を正確に行うという機能モデルを公表した。
真核生物ペプチド鎖解離因子のコドン識別機能ドメインを特定する為に、既知の立体構造情報を応用し、通常の3つの終止コドン(UAA・UAG・UGA)を認識する出芽酵母由来eRF1と、例外的な終止コドン(UGAのみ)を用いるテトラヒメナ由来のeRF1とのドメインごとのキメラ体産生遺伝子をデザインした。このキメラ体蛋白質および、同蛋白質に、系統的な変異導入を行った変異体のin vivoおよび、in vitro解析結果により、ドメインIがコドン特異性を決定することを明らかにした。
また、翻訳終結過程の最終段階であるリボソーム再生過程における、伸長因子EF-Gと、リボソーム再生因子との相互作用ドメインを系統的な遺伝学手法と、生化学手法により検索した。その結果、リボソーム再生因子との相互作用部位として、EF-GのtRNA擬態領域であるドメインIV-Vの立体構造上の特定の領域に局在するアミノ酸残基群を特定した。
以上の、研究成果により、「解離因子-tRNA擬態仮説」の具体的な実証を進めつつ、さらに、翻訳終結に関わるその他の蛋白質群が、tRNA擬態性ドメインを有効な機能領域として用いている事を明らかにできた。

【研究種目】基盤研究(B)

【研究期間】2001 - 2002

【配分額】15,200千円 (直接経費: 15,200千円)

【研究分野】分子生物学

【研究領域課題番号】08044196 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

タンパク質合成 / 翻訳終結 / 終止コドン / ペプチド鎖解離因子 / 分子擬態 / tRNA / リボゾーム / 高度好熱菌 / ペプチド鎖解難因子 / tRMA / リボソーム / テトラヒメナ / 遺伝子発現の転写後調節

【研究成果の概要】

タンパク質合成(翻訳)の終結機構の研究は、2つの点で重要である。第1に、遺伝暗号の解読機構は1970年前にその基本機構が完全に解明されたと理解されているが、その認識は誤りである。翻訳終結については、(1)終止コドンの認識、(2)23S rRNAのリボザイムによるペプチド鎖の切断、(3)リボソーム複合体の最終解離、等の基本的な問題が分子レベルで未解決である。第2に、終止コドンは翻訳の停止信号とならない事例が生物種を問わず数多く発見されている。フレームシフトやアミノ酸の読み替え等、暗号解読の普遍則から外れた翻訳現象が、リコーディング機構と命名されて、翻訳研究のフロンティアとなっている。終止コドンで翻訳を、「止めるべきが、止めざるべきが」、それが問題となるようになってきたのである。さらに、翻訳終結の効率を調節することによる遺伝子発現の制御システムの存在も明かになってきた。このような理由がら、「終止コドンの認識→プペチド鎖切断→リポソーム複合体の解離」に至る翻訳終結の基本的な分子機構に関する研究を、大腸菌および酵母のモデル系で優先的に実施する必要性から、本研究を行った。終止コドン認識に関する研究のブレークスルーは、翻訳調節に働く一群のタンパク質が、核酸であるtRNAの構造とそっくり、という「分子擬態」の発見である。我々は、終結に働く解離因子がアンチコドンをも擬態し終止コドンを認識すると考え、分子擬態(molecular mimicry)仮説を提出した。タンパク質とRNAの分子擬態は、生物学にとって新しい概念であり、生命がRNAワールドがらタンパク質(DNA)ワールドへと進化してきたことを考えれば、生命の根幹に係わる基本的な原理のひとつと考えられる。この研究は、基礎生物学に役立つのみならず、バイオテクノロジーに新たな技術を生み出すチャレンジともいえる。現在、分子擬態の基盤原理の解明とともに、タンパク質による遺伝暗号の解読という新しい領域を確立する方向へ研究を進めている。

【研究種目】国際学術研究

【研究期間】1996 - 1998

【配分額】35,700千円 (直接経費: 35,700千円)

【研究分野】機能生物化学

【研究領域課題番号】08780577 (KAKENデータベースで見る）

【研究キーワード】

分子擬態 / 翻訳終結 / ペプチド鎖解離因子 / GTP結合性タンパク質 / リボソーム

【研究成果の概要】

すでに様々なG蛋白質で機能的役割が明らかにされているGドメインの保存アミノ酸配列に変異を導入した。これらのGドメイン機能の欠損が著しいことが予想される変異RF-3はin vivoにおいて発現を誘導すると優勢致死性を示した。RF-3においては他の翻訳伸長因子同様にGTPの加水分解によるGTP->GDPの変換過程が翻訳終結のモード変換に関わるものと考えられる。また、翻訳終結触媒活性を指標とし機能強化型RF-3変異(sra変異)の分離を行いRF-3機能ドメインの検索・解析を行った。sra変異はすべての終止コドンにおける翻訳終結反応を促進する。また、これらの変異はRF-3のアミノ酸配列上の2つの領域に集中して分離され、この領域がRF-3の翻訳終結反応に関わる重要な機能ドメインを形成していることが考えられる。また、GTP結合性翻訳伸長因子との比較解析を行うことにより、RF-3がこれらの翻訳伸長因子に類似する性質を持つものであることが明らかになってきた。
GTP結合性翻訳伸長因子ホモログであるRF-3(真核ではeRF-3)の解析を通じて我々は、全ての生物において、終止コドンの情報の解読機構が機能的・構造的にtRNAに擬態した解離因子とRF-3などの翻訳伸長因子ホモログタンパク質により、センスコドンに対するrRNAと同様な分子的基盤によって行われるという新たな仮説、「RF-tRNA mimicry仮説」を提唱しこれを公表した。

【研究種目】奨励研究(A)

【研究期間】1996

【配分額】1,000千円 (直接経費: 1,000千円)