Discovery Sagaサイレントキーワード俯瞰

酵素反応 / 不斉脱炭酸反応 / 基質特異性 / ランダム変異 / 部位特異的変異 / プラスミド / 不斉脱炭素反応 / 活性部位特異的阻害剤 / 立体配座 / 活性化エントロビ- / CH-π相互作用 / チオールエステル結合 / システイン

我々が発見した二置換マロン酸を不斉脱炭酸する酵素(AMDase)は補因子を全く必要としない非常にユニークな脱炭酸酵素であり、240個のアミノ酸からなる。4個含まれるシステインの内1個が活性部位にあって、反応に重要な役割を担っていることが明らかになっている。部位特異的変異によってこれらのシステインのうち何れか1個だけをセリンに変えた変異酵素4種類を作ってその活性をそれぞれ調べた。その結果、N端から数えて188番目のCysをSerに変えると活性が極端に小さくなることが明らかになった。この事から、このCysが酵素活性に直接関与していると推定できる。
基質である二塩基酸がどの様に酵素の活性部位に結合し、またシステインが基質を活性化するのにどの様な役割を果たしているかは非常に興味がもたれるところである。これらのことについて様々な基質や阻害剤を利用して詳細に検討した。まず、基質の活性部位内での立体配座であるが、幾つかの化合物の反応性、ミカエリス定数等からベンゼン環がある配座に固定されているだろう事が推定できた。その固定のための少なくとも1つは、酵素の芳香族アミノ酸残基と基質のベンゼン環の間に形成されるCH-p結合であることがあきらかとなった。
酵素をコードする遺伝子のランダム変異によって基質特異性を変化させる試みを行った。具体的には、2重鎖DNAに亜硝酸を作用させた。その遺伝子断片を再びプラスミドのつないで大腸菌を形質転換し、メチル基の代わりにエチル置換基を有する化合物に対して活性を有する株を検索した。残念ながら、7000株の中から目的のものを見つけることはできなかったが、野生株より活性の高い酵素が見出した。

酵素反応 / 不斉脱炭酸反応 / コンフォメーション / 活性部位特異的阻害剤 / チオールエステル結合 / システイン

我々が発見した二置換マロン酸を不斉脱炭酸する酵素は補因子を全く必要としない非常にユニークな酵素である。この酵素がどの様にして基質を活性化するかを調べる目的で先ずインダンジカルボン酸を基質として反応を行った。この化合物は速度定数は小さいものの酵素とのKmは他の基質より一桁小さく、酵素と非常に親和性が大きいことが明らかとなった。これは反応の際に基質のコンフォメーションが厳しく規制されていることを示す。反応に寄与する最も可能性の高いコンフォメーションについては理論計算の結果も加味して決定することができた。現在、酵素と基質の芳香核同士の相互作用をより詳細に検討しているところである。次に、活性部位特異的競争阻害剤を検索し、それに関与するアミノ酸残基等に関する知見を得ることを試みた。その結果α-ブロムフェニル酢酸が優れた効果を有することが明らかとなった。この阻害剤を用いて、酵素との複合体をつくり、質量分析、CDスペクトル、プロテアーゼ分解等の結果を総合して次の様なことが明らかとなった。1)酵素はまず第1段階としては基質とチオールエステル結合を生成し、他方のカルボキシル基を活性化しているのであろう。2)チオールエステル生成に関与しているアミノ酸残基はアミノ末端から171番目のシステインである可能性が高い。