3次元培養技術を用いてiPS細胞から機能的なCD4陽性iNKT細胞の作製に成功

2026年4月23日

発表のポイント

人工胸腺オルガノイド（ATO）を用いた3次元培養により、インバリアントナチュラルキラーT（iNKT）細胞由来のiPS細胞からCD4陽性（CD4⁺）iNKT細胞を作製することに成功した。
作製したCD4⁺ iNKT細胞は、特異的な抗原からの刺激により増殖し、サイトカイン（IFN-γ、IL-4）を産生することで樹状細胞の成熟を促す「アジュバント効果」をもつことを明らかにした。
さらに、固形がんの免疫回避機構であるM2マクロファージによるT細胞の増殖抑制を、抗原特異的に解除できることを示した。
本技術により、固形がんに対する免疫療法の効果を高めるための新たな細胞ソースとしての活用が期待される。

1. 要旨
　椎名沙羅研究員（研究当時：CiRA増殖分化機構研究部門）、金子新教授（CiRA臨床応用研究部門）らの研究グループは、人工胸腺オルガノイド（Artificial Thymic Organoid, ATO）^注1）を用いた3次元培養法により、iPS細胞から機能的なCD4^注2）陽性インバリアントナチュラルキラー（invariant natural killer T, iNKT）細胞^注3）を誘導することに成功しました。

　研究グループはこれまでに、2次元培養によりiPS細胞からiNKT細胞を作製する方法を開発しています（CiRAニュース2016年2月9日）。しかし、この方法では、CD4とCD8^注4）の両方が発現していない（Double Negative: DN）細胞までの誘導に限られていました。このため、多様な機能を発揮する生体内のiNKT細胞と比べると未成熟であり、医療応用のための課題となっていました。

　本研究では、人工胸腺オルガノイドを用いた3次元培養技術を導入することで、高い増殖能力と、サイトカイン^注5）産生能や樹状細胞^注6）の成熟を促す能力を備えたCD4⁺ iNKT細胞の作製を可能にしました。さらに、作製した細胞は、固形がんに対する免疫細胞療法を困難にする要因の一つである免疫抑制環境を改善する能力をもつ可能性も示しました。本成果は、固形がんに対するiNKT細胞を用いた新たな免疫療法の実用化に向けた重要な研究成果です。

　本研究成果は、2026年1月9日に科学誌「Communications Biology」に掲載されました。 2. 研究の背景
　インバリアントナチュラルキラーT（iNKT）細胞は、全ての人で共通（invariant: 不変の）のT細胞受容体（TCR）をもち、特定の糖脂質を認識して活性化する免疫細胞です。iNKT細胞のうちCD4を発現するCD4⁺ iNKT細胞は抗原を認識し、他の免疫細胞の活性化を介して強力な抗腫瘍効果を発揮するため、がん治療の有力な候補として注目されています。

　しかし、iNKT細胞は末梢血中に0.1%未満しか存在せず、治療に必要な細胞数を確保することが困難でした。研究グループはこれまでに、iPS細胞技術を用いてiNKT細胞を大量に作製する研究を行ってきましたが、従来の２次元培養法で作製したiNKT細胞はCD4を発現しておらず、増殖能やヘルパーサイトカイン産生能について課題が残っていました。 3. 研究結果
1）人工胸腺オルガノイドを用いた３次元培養によるCD4⁺ iNKT細胞の誘導
　研究グループは、固有のT細胞受容体をもつiNKT細胞を初期化し作製したヒトiPS細胞に対して、人工胸腺オルガノイドを利用する3次元培養法（ATO法）を適用することで、iNKT細胞への分化誘導に取り組みました。その結果、従来の2次元培養法では得られなかったCD4単独陽性細胞（3D-CD4⁺ iNKT細胞）を作製することに成功し、成熟したiNKT細胞にみられるCD5の発現も確認しました（図1A）。また、3D-CD4⁺ iNKT細胞は、２次元培養法で分化誘導したiNKT細胞（2D-re-iNKT細胞）と比較して、抗原刺激を与えると高い増殖能力を示すことも明らかになりました（図1B）。


図1. ATO法によるiNKT細胞の誘導
A：ATO法を用いて作製された細胞のフローサイトメトリー^注7）解析。CD4陽性かつCD5陽性のiNKT細胞が誘導された。
B：抗原α-galactosylceramide（α-GC）による刺激後の各種iNKT細胞の増殖率。3D-CD4⁺ iNKT細胞（青：3D-CD4）は2D-re-iNKT細胞（黒：2D）よりも高く、末梢血iNKT細胞（紫：primary CD4）に近しい増殖率を示した。
2）3D-CD4⁺ iNKT細胞によるアジュバント効果
　次に、3D-CD4⁺ iNKT細胞が、樹状細胞の成熟を促す「アジュバント効果」を誘導できるかを評価するため、未成熟な樹状細胞（DC）との共培養を行いました。その結果、3D-CD4+ iNKT細胞と樹状細胞とを共培養し、抗原刺激（αGC）を与えた場合に、樹状細胞において、成熟した樹状細胞の指標となるタンパク質（CD80、CD86、HLA-DR）発現の上昇がみられ、がんに対する免疫に重要なIL-12p70の産生も誘導されました（図2A, B）。

　さらに、樹状細胞との共培養において3D-CD4⁺ iNKT細胞は、IFN-γだけではなく、2D-re-iNKT細胞では産生されなかったIL-4などのサイトカインを豊富に産生することが確認されました（図2C）。これらのサイトカインは、樹状細胞の成熟を促すことが知られています。以上より、3D-CD4⁺ iNKT細胞は2D-re-iNKT細胞よりも高いアジュバント効果をもつことが示されました。


図2. 3D-CD4⁺ iNKT細胞による樹状細胞の成熟化とサイトカイン産生
A：各iNKT細胞と未成熟な樹状細胞（DC）を共培養した場合のDCの成熟マーカーの発現量。3D-CD4⁺ iNKT細胞（青：3D-CD4）は末梢血iNKT細胞（紫：primary CD4）同様にαGC存在下において成熟マーカーの発現量を上昇させた。
B：各iNKT細胞との共培養によりDCから産生されるIL-12p70の産生量。3D-CD4⁺ iNKT細胞（青）との共培養では2D-re-iNKT細胞（黄：2D）との共培養より多くのIL-12p70が産生された。
C：DCとの共培養時に3D-CD4⁺ iNKT細胞から産生されるサイトカイン（IFN-γ、IL-4）の分泌量。3D-CD4⁺ iNKT細胞（青）はIFN-γやIL-4など多様なサイトカインを産生することが確認された。
3）免疫抑制性マクロファージM2によるT細胞増殖阻害を解除する
　固形がんの腫瘍内部には、免疫抑制性のM2マクロファージ^注8）が多く存在し、T細胞の増殖を抑制することで、免疫細胞による攻撃を回避する環境を構築することが知られています。そこで、ヒト末梢血由来細胞からM2マクロファージを作製し、T細胞および3D-CD4⁺ iNKT細胞と共培養し、T細胞の増殖への影響を調べました。その結果、3D-CD4⁺ iNKT細胞を加え、特異的な抗原刺激を与えることにより、M2マクロファージによるT細胞の増殖抑制効果（図3A）が解除され、T細胞の増殖が促進されることが確認されました（図3B）。


図3. M2マクロファージに対するT細胞増殖抑制とその解除
A：免疫抑制性のM2マクロファージを作製し、蛍光色素（CFSE^注9））で標識したT細胞と共培養すると、細胞分裂による蛍光強度（横軸）の減弱が阻害されたことから、T細胞の増殖が抑制されたことがわかる。
B：M2マクロファージ、CFSEで標識したT細胞、抗原刺激を与えた3D-CD4⁺ iNKT細胞を共培養すると、M2マクロファージによる抑制が解除され、T細胞の増殖が回復した。 4. まとめ
　本研究では、人工胸腺オルガノイドを用いた3次元培養方法を適用することで、iPS細胞から強力なアジュバント機能をもつCD4陽性iNKT細胞を作製することに成功しました。3D-CD4⁺ iNKT細胞は、特異的な抗原刺激のもとで、樹状細胞を成熟させ、腫瘍微小環境を模したM2マクロファージによる免疫抑制効果を解除することが示されました。今後は、本手法で作製された細胞を固形がんに対する既存のT細胞免疫療法と組み合わせることで、より効果的な治療法の開発につながることが期待されます。

論文情報

論文名
Artificial thymic organoid culture generates functional iPSC-derived CD4+ invariant natural killer T cells
doi: 10.1038/s42003-025-09462-1

ジャーナル名
Communications Biology
著者
Sara Shiina^1,2, Tatsuki Ueda¹, Shoichi Iriguchi^1,2, Yasushi Uemura³, Shin Kaneko^1,2,4*
*：責任著者
著者の所属機関
京都大学iPS細胞研究所（CiRA）
タケダ-CiRA共同研究プログラム（T-CiRA）
国立がん研究センター 先端医療開発センター
筑波大学トランスボーダー医学研究センター（TMRC）

（所属は研究当時のもの）

研究助成

本研究は、下記機関より支援を受けて実施されました。

科学技術振興機構（JST）次世代研究者挑戦的研究プログラム（JPMJSP2110）
タケダ-CiRA共同研究プログラム（T-CiRA）

用語解説

注1）人工胸腺オルガノイド（Artificial Thymic Organoid, ATO）
特定の分化状態の誘導や維持を補助するマウスフィーダー細胞（MS5）に、ヒト胸腺上皮細胞でT細胞分化に関わる遺伝子（hDLL4）を導入し、三次元培養することで、胸腺の環境を模倣したオルガノイド。幹細胞からT細胞への分化および成熟過程を体外で再現するための細胞培養系。
注2）CD4
免疫細胞の分類のための指標（マーカー分子）として使われる細胞表面上のタンパク質の一種。CD4はヘルパーT細胞や樹状細胞、マクロファージ、制御性T細胞などで発現する。
注3）インバリアントナチュラルキラーT（invariant natural killer T, iNKT）細胞
T細胞は提示された抗原を認識するT細胞受容体を細胞表面にもち、通常、多様なT細胞受容体が存在してT細胞ごとにそれぞれ異なる抗原を認識する。T細胞の一種で、樹状細胞上などに発現しているCD1d分子に結合する糖脂質抗原α-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）を認識するT細胞受容体をもつものをナチュラルキラーT（NKT）細胞と呼び、iNKT細胞はその大部分を占める細胞。iNKT細胞には通常１種類のT細胞受容体しかない。iNKT細胞は活性化すると、樹状細胞を活性化し、自然免疫や獲得免疫応答に大きな役割を果たす。
注4）CD8
細胞表面上のマーカー分子の一種。CD8はキラーT細胞やNK細胞、樹状細胞などで発言する。
注5）サイトカイン
さまざまな細胞から分泌され、特定の細胞の働きに作用するタンパク質のこと。本記事では、樹状細胞の成熟を促すIFN-γやIL4のほか、IL-12p70が該当する。
注6）樹状細胞
免疫細胞の一種。生体内の異物を取り込んで分解し、その抗原を細胞表面に提示して、T細胞など他の免疫細胞を活性化させる。
注7）フローサイトメトリー
流動細胞計測法。レーザー光を用いて光散乱や蛍光測定を行うことにより、水流の中を通過する単一細胞の大きさ、DNA量など、細胞の生物学的特徴を解析することができる。
注8）M2マクロファージ
組織の修復や免疫反応の抑制に関与するマクロファージの一種。固形腫瘍においては腫瘍関連マクロファージとして存在し、免疫細胞を抑制してがんの進行を促進する役割を果たす。
注9）CFSE
細胞の分裂や増殖を評価するために用いられる細胞標識用の蛍光色素。CFSEで標識された細胞は分裂するたびにCFSEの蛍光強度が弱くなる。そのため、蛍光強度が低いほど細胞が増殖していることが評価できる。